第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報2000年第21卷第4期

商立軍　臧益民　王春梅　臧偉進　董明清　陳賢明　王四旺

　　摘　要:目的　觀察降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）對急性分離心肌細胞在模擬缺血缺氧狀態(tài) 下胞內(nèi)鈣的影響.方法　急性分離心肌細胞在模擬缺血缺氧狀態(tài)下，以Fluo-3作為鈣指示劑，用共聚焦顯微鏡測定胞內(nèi)鈣的變化.結(jié)果　急性缺血缺氧時，心 肌細胞胞內(nèi)鈣濃度降低，加入CGRP后，鈣濃度恢復(fù)；先加入CGRP,再在缺血缺氧的條件下，胞內(nèi)鈣濃度基本保持不變.結(jié)論　CGRP可恢復(fù)因急性缺血缺氧而導(dǎo)致的細胞內(nèi)鈣濃度降低.

　　關(guān)鍵詞：降鈣素基因相關(guān)肽；缺血；缺氧；肌細胞；胞內(nèi)鈣；Fluo-3

　　0　引言

　　降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）是一種內(nèi)源性生物活性多肽，對心血管系統(tǒng)的活動具有十分重要的調(diào)節(jié)作用，有明顯的抗心律失常作用，可引起正常及缺血狀態(tài)下心肌細胞離子通道的變化，但其作用機制尚有待進一步研究. 在模擬缺血缺氧狀態(tài)下,我們用共聚焦顯微鏡結(jié)合Fluo-3染色技術(shù),觀察C gRP對急性分離心肌細胞胞內(nèi)鈣的影響.

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　1.1.1　液體配置臺氏液（單位為mmol·L^-1）　NaCl143, KCl 5.40, Mg Cl₂ 0.50, CaCl₂ 1.80, HEPES 5.00, NaH₂PO₄0.33, Glucose 5.50, pH值用NaOH調(diào)至7.35 . 無鈣臺氏液：臺氏液中去除 CaCl₂即可.含酶液：無鈣臺氏液中加入0.1 g·L^-1膠原 酶和0.7 g·L^-1的BSA. KB液（單位為 mmol·L^-1）： l-glutamic acid 70, KCl 25, taurine 20, KH₂PO₄ 10, MgCl₂3, HEPES 10, Glu cose 10, EGTA 0.50, pH值用KOH調(diào)至7.35.模擬缺血缺氧液：臺氏液中去除 Glucose,將 pH值降到6.8，且實驗前用純氮氣飽和至少1 h. CGRP在實驗前加入到臺氏液中，zui終濃度為 1 nmol·L^-1.

　　1.1.2　豚鼠心肌細胞分離　豚鼠由本校實驗動物中心提供，雌雄不拘，體質(zhì)量200～250 g，10 g·L^-1戊巴比妥鈉（ip40 mg·kg^-1）麻醉. 氣管插管后在正壓人工呼吸狀態(tài)下開胸，充分暴露心臟和升主動脈，然后在原位進行主動脈插管，摘出心臟后置于Langendorff裝置進行主動脈逆向灌流（灌流與插管同步進行）. 先用臺氏液灌流3 min左右，復(fù)跳以充分沖洗冠脈內(nèi)殘血，再用無鈣臺氏液灌流直至心臟*停跳. 再用含有0.1 g·L^-1膠原酶（Yakult,日本）和0.7 g·L^-1 BSA（華美公司）的無鈣臺氏液灌注約5 min，zui后用KB液沖洗殘酶 約5 min. 將心臟從Langendorff裝置上取下，置于37℃ kB液中剪碎，溫育，吹打5～10 m in. 經(jīng)過濾后置于室溫下靜置1 h后進行實驗. 整個灌流系統(tǒng)溫度保持在37℃，所有液體均用純氧飽和.

　　1.2　方法　急性分離心肌細胞在模擬缺血缺氧狀態(tài)下胞內(nèi)鈣離子的測定原理: f luo-3是一種敏感性鈣指示劑，能特異性地與Ca²⁺結(jié)合，并在一定波長激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生熒光，且與Ca²⁺結(jié)合后其熒光光譜發(fā)生變化，其熒光強度與Ca²⁺濃度成正比，因而可用于觀察Ca²⁺的動態(tài)變化，但Fluo-3為極性大的酸性化合物，難以進入細胞，而當(dāng)其結(jié)合上親脂的乙酰氫甲基酯成為脂溶性的Fluo-3/AM,再與細胞溫育時，很容易透過細胞膜，胞質(zhì)內(nèi)的非特異性酯酶將其酯解脫去脂基生成游離的Fluo-3.

　　1.2.1　Fluo-3/AM的負載　用臺氏液洗滌標本2次后，于室溫避光條件下 用Fluo-3/AM（10 mg·L^-1）負載細胞約30 min. fluo-3/AM預(yù)先按1 g·L^-1溶 于DMSO配制，混勻后存于-20℃.然后將細胞滴加到特制的培養(yǎng)皿中，靜置貼壁后再用臺氏液沖洗細胞2～3次，即可在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察、測量.

　　1.2.2　細胞內(nèi)鈣的測定　將負載后的細胞放在特制的培養(yǎng)皿下，常溫下測定所選定的 細胞內(nèi)的鈣值，然后依實驗條件分別加入含CGRP的臺氏液、缺血缺氧液或正常臺氏液，時間間隔5～10 min,分別測定各時間點的鈣值，動態(tài)掃描細胞內(nèi)熒光強度變化.我們使用的是 Bio Rad 公司的MRC-1024 LSCM，其單幅采樣頻率可達4 hz，如需觀察Ca²⁺的快速變化，可線掃方式，則其采樣頻率為488 Hz. 與Ca²⁺結(jié)合的Fluo-3可以被488 nm的氬 離子激光激發(fā)，可在525 nm處探測到熒光發(fā)射，其熒光強度的變化可指示胞內(nèi)游離鈣濃度的相對變化. 未經(jīng)校對時雖不能得到［Ca²⁺］_i的值，但通過記錄熒光強度的變化，可觀察到胞內(nèi)［Ca²⁺］_i的空間分布及藥物等條件改變時胞內(nèi)［ ca²⁺］_i的變化幅度.

　　2　結(jié)果

　　2.1　CGRP對缺血缺氧后胞內(nèi)鈣的影響　心肌急性缺血缺氧即刻，胞內(nèi)鈣降低且基本穩(wěn)定,1 min后加入CGRP可見胞內(nèi)鈣濃度迅速升高 ，5 min后繼續(xù)升高，可上升到未缺血缺氧前的水平.然后用臺氏液洗脫上述作用，胞內(nèi)鈣又回復(fù)到缺血缺氧后的狀態(tài)（Fig 1）.

　　2.2　預(yù)先加入CGRP再缺血缺氧時胞內(nèi)鈣的變化　先加入CGRP可略微升高胞內(nèi)鈣的值，但不顯著且隨時間的延長，5 min及10 min升高的幅度不大.此時加入缺血缺氧液，胞內(nèi)鈣幾乎沒有變化；開始時整體都略有抬高，但3 min后 即恢復(fù)，10 min后用臺氏液洗脫，胞內(nèi)鈣值能回復(fù)到靜息狀態(tài)的水平（Fig2）.

圖 1　缺血缺氧后加入CGRP細胞內(nèi)熒光光密度曲線

　　fig 1　Intracellular fluorescence intensity curves under ischemia/hypoxia, and then with CGRP

圖 2　預(yù)先加入CGRP再缺血缺氧時細胞內(nèi)熒光光密度曲線

　　fig 2　Intracellular fluorescence intensity curves under ischemia/hypoxi a with added CGRP in advance

　　3　討論

　　細胞內(nèi)游離Ca²⁺在細胞信息傳遞過程中起著重要的作用.［Ca²⁺］ _i能反映細胞的狀態(tài)、藥物和環(huán)境等對細胞的影響.測量細胞內(nèi)游離Ca²⁺的方法有：鈣離子選擇性微電極法 、放射示蹤法和標記示蹤法等^［1］.我們采用第三代Ca²⁺熒光指示劑Fluo-3 , 利用激光共聚焦掃描技術(shù)來 觀察胞內(nèi)Ca²⁺的空間和時間變化. fluo-3是*在可見光區(qū)有激發(fā)峰的熒光劑，可 以避免紫外光對細胞的損害和激發(fā)自熒光傾向，它和Ca²⁺結(jié)合后熒光強度增強40倍,故Fluo-3適用于觀察Ca²⁺的空間分布和快速時間變化,是目前熒光劑中性能*，應(yīng)用zui多的一種.

　　CGRP對缺血缺氧時胞內(nèi)鈣的影響可能是各種因素共同作用的結(jié)果：首先,細胞處于急性 缺血缺氧早期狀態(tài)時，膜去極化可導(dǎo)致Ca²⁺內(nèi)流減少，從而使胞內(nèi)鈣濃度降低.同時 ，缺血 時細胞內(nèi)ATP水平降低，可激活I(lǐng)_K，ATP電流，使心肌細胞復(fù)極明顯加速，從而使進入細胞內(nèi) Ca²⁺減少. 再者,CGRP 可激活Ca²⁺通道，促進L型Ca²⁺內(nèi)流增加，使胞內(nèi)鈣濃度升高. 這可 能是因為CGRP通過作用于其特異受體，激活細胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶-環(huán)磷酸腺苷系統(tǒng)，引起cA m P增加,再激活某種蛋白激酶，使鈣通道蛋白磷酸化，增加鈣通道的開放概率和時間的緣故.另外還有,Ca²⁺引起Ca²⁺釋放（calcium-induced calcium release, CICR）的 機制等^［2-4］.我們的研究結(jié)果表明，在急性缺血缺氧時,急性分離心肌細胞胞內(nèi)鈣濃度降低，CGRP可引起 胞內(nèi)鈣濃度稍微升高，且可改變?nèi)毖毖跻鸬陌麅?nèi)鈣濃度的降低.這種鈣的變化無疑改變了細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，同時也說明胞內(nèi)鈣是受多種復(fù)雜因素調(diào)控的，其詳細機制還需進一步實驗來闡明.

　　基金項目:國家自然科學(xué)基金資助項目（39970273）

　　作者簡介：商立軍（1969-）, 男（漢族），河南省濟源市人.講師，博士生 （導(dǎo)師臧益民）. 已發(fā)表論文30篇. .（029）3374521商立軍（第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部:生理學(xué)教研室，陜西西安 710033）

　　臧益民（第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部:生理學(xué)教研室，陜西 西安710033）

　　董明清（第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部:生理學(xué)教研室，陜西 西安710033）

　　王春梅（第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部:中心實驗室，陜西 西安 710033）

　　臧偉進（西安醫(yī)科大學(xué)心血管生理藥理研究室,第四軍醫(yī)大學(xué)）

　　陳賢明（西安醫(yī)科大學(xué)西京醫(yī)院耳鼻咽喉科,第四軍醫(yī)大學(xué)）

　　王四旺（西安醫(yī)科大學(xué)心藥物研究所,第四軍醫(yī)大學(xué)）

　　參考文獻:

　?。?］ Brandes R, Figueredo vM, Camacho SA et al. Quantitation of cytosolic ［Ca²⁺］_i in whole perfused rat hearts using indo-1 fluorome try［J］, Biophys J,1993;65:1973-1979.

　?。?］ Cornfield DN, Stevens T, Mcmurtry IF et al. Hypoxia-induced i ncrease in fetal pulmonary artery smooth muscle cell ［Ca²⁺］_i is mediat ed by entry of Ca²⁺ through voltage-operated Ca²⁺ channels （A bstract）［J］. Pediatr Res, 1993;33:320-321.

　?。?］ Berridge MJ. Elementary and global aspects of calcium signalling ［J］. j Physiol, 1997;499（2）:291-306.

　?。?］ Lopez-lopez JR, Shacklock PS, Balke CW et al. Local calcium tra nsients triggered by single L-type calcium channel currents in cardiac cells［J］. Science,1995;268（5213）:1042-1045