為了方便理解，這里羅列一下堿法質粒抽提用到三種溶液： 溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0； 溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS； 溶液III，3 M 醋酸鉀 / 2 M 醋酸。 讓我們先來看看溶液I的作用。任何生物化學反應，首先要控制好溶液的pH，因此用適當濃度的和適當pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不過的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？說起來不可思議，加了葡萄糖后zui大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實對質粒的抽提本身而言，幾乎沒有任何影響。所以說溶液I中葡萄糖是可缺的。那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca²⁺和Mg²⁺等二價金屬離子的螯合劑，配在分子生物學試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長。在溶液I中加入高達 10 mM 的EDTA，無非就是要把大腸桿菌細胞中的所有二價金屬離子都螯合掉。如果不加EDTA，其實也沒什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太長的時間里完成質粒抽提，就不用怕DNA會迅速被降解，因為zui終溶解質粒的TE緩沖液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提質粒呢？實話告訴你，只要用等體積的水，或LB培養(yǎng)基來懸浮菌體就可以了。

有一點不能忘的是，菌體一定要懸浮均勻，不能有結塊。 輪到溶液II了。這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2％的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，無非是為了保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。很多人不知道其實破細胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實上NaOH是* 的溶解細胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細胞，碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解，這是由于細胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結構向micelle（微囊）結構的相變化所導致。用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌（不妨可以自己試一下），自然就難率抽提得到質粒。如果只用SDS當然也能抽提得到少量質粒，因為SDS也是堿性的，只是弱了點而已。很多人對NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒有正確理解一些書上的有關DNA變性復性的描述所導致。有人不禁要問，既然是NaOH溶解的細胞，那為什么要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點：*，時間不能過長，千萬不要這時候去接，因為在這樣的堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合（象對待女孩子一樣），不然基因組DNA也會斷裂。基因組DNA的斷裂會帶來麻煩，后面我再詳細說明。

每個人都知道，溶液III加入后就會有大量的沉淀，但大部分人卻不明白這沉淀的本質。zui容易產生的誤解是，當SDS碰到酸性后發(fā)生的沉淀。如果你這樣懷疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現(xiàn)，顯然與SDS的加入有關系。如果在溶液II中不加SDS會怎樣呢，也會有少量的沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來的蛋白質。既然SDS不是遇酸發(fā)生的沉淀，那會不會是遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你會發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會產生沉淀的。因此高濃度的鹽導致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多。這其實是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來，溶液III加入后的沉淀實際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更*。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質結合，平均兩個氨基酸上結合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。這個過程不難想象，因為基因組DNA太長了，長長的DNA自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結合。

那么2 M的醋酸又是為什么而加的呢？是為了中和NaOH，因為長時間的堿性條件會打斷DNA，所以要中和之。基因組DNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50－100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被PDS共沉淀了。所以堿處理的時間要短，而且不得激烈振蕩，不然zui后得到的質粒上總會有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。很多人誤認為是溶液III加入后基因組DNA無法快速復性就被沉淀了，這是天大的誤會，因為變性的也好復性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本來是為了溶解細胞而用的，DNA分子的變性其實是個副產物，與它是不是沉淀下來其實沒有關系。溶液III加入并混合均勻后在冰上放置，目的是為了PDS沉淀更充分一點。

不要以為PDS沉淀的形成就能將所有的蛋白質沉淀了，其實還有很多蛋白質不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/異戊醇進行抽提，然后進行酒精沉淀才能得到質量穩(wěn)定的質粒DNA，不然時間一長就會因為混入的DNase而發(fā)生降解。這里用25/24/1的酚/氯仿/異戊醇是有很多道理的，這里做個全面的介紹。酚（Phenol）對蛋白質的變性作用遠大于氯仿，按道理應該用酚來zui大程度將蛋白質抽提掉，但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液（比如4M的異硫氰酸胍），離心后酚相會跑到上層，不利于含質粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；還有一點，酚與水有很大的互溶性，如果單獨用酚抽提后會有大量的酚溶解到水相中，而酚會抑制很多酶反應（比如限制性酶切反應），因此如果單獨用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液進行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時就會被除干凈而不必擔心酶切等反應不能正常進行。至于異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，也方便了水相的回收。

回收后的水相含有足夠多的鹽，因此只要加入2倍體積的乙醇，在室溫放置幾分鐘后離心就可以將質粒DNA沉淀出來。這時候如果放到－20℃，時間一長反而會導致大量鹽的沉淀，這點不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要過分小心了。高濃度的鹽會水合大量的水分子，因此DNA分子之間就容易形成氫鍵而發(fā)生沉淀。如果感覺發(fā)生了鹽的沉淀，就用70％的乙醇多洗幾次，每次在室溫放置一個小時以上，并用tip將沉淀打碎，就能得到好的樣品。得到的質粒樣品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE緩沖液進行溶解，不然大量未降解的RNA會干擾電泳結果的.

瓊脂糖電泳進行鑒定質粒DNA時，多數(shù)情況下你能看到三條帶，但千萬不要認為你看到的是超螺旋、線性和開環(huán)這三條帶。堿法抽提得到質粒樣品中不含線性DNA，不信的話你用EcoRI來線性化質粒后再進行瓊脂糖電泳，就會看到線性質粒DNA的位置與這三條帶的位置不一樣。其實這三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開環(huán)和復制中間體（即沒有復制*的兩個質粒連在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后過度振蕩，會有第四條帶，這條帶泳動得較慢，遠離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。 非常偶然的是，有時候抽提到的質粒會有7－10條帶，這是由于特殊的DNA序列導致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈數(shù)不同）所致。這里暫不深究。

 已經提出過許多方法用于從細菌中提純質粒DNA， 這些方法都含有以下3個步驟：
細菌培養(yǎng)物的生長。
細菌的收獲和裂解
質粒DNA的純化。

（一）細菌培養(yǎng)物的生長
從瓊脂平板上挑取一個單菌落，接種到培養(yǎng)物中（有含有行當抗生素的液體培養(yǎng)基中生長），然后從中純化質粒，質粒的提純幾乎總是如此?，F(xiàn)在使用的許多質粒載體（如pUC系列）都能復制到很高的拷貝數(shù)，惟致只要將培養(yǎng)物放在標準LB 培養(yǎng)基中生長到對數(shù)晚期，就可以大量提純質粒。此時，不必造反性地擴增質粒DNA。然而，較長一代的載體（如pBR322）由于不能如此自由地復制，所以需要在得到部分生長的細菌培養(yǎng)物中加入氯霉素繼續(xù)培養(yǎng)若干小時，以便對質粒進行性擴增。氯霉素可抑制宿主的蛋白質合成，結果阻止了細菌染色體的復制，然而，松弛型質粒仍可繼續(xù)復制，在若干小時內，其拷貝數(shù)持續(xù)遞增。這樣，像pBR322－類的質粒，從經氯霉素處理和未經處理的培養(yǎng)物中提取質粒的產量迥然不同，前者大為增高。多年來，加入足以*抑制蛋白質合成的氯霉素μg/ml）已成為標準的操作、用該方法提取的質粒DNA量，對于分子克隆中幾乎所有想象到的工作任務。

（二）細菌的收獲和裂解
細菌的收獲可通過離心來進行，而細菌的裂解則可以采用多種方法中的任意一種，這些方法包括用非離子型或離子型去污劑、有機溶劑或堿進行處理及用加熱處理等。選擇哪一種方法取決于3個因素：質粒的大小、小腸桿菌菌株及裂解后用于純化質粒DNA的技術。 盡管針對質粒和宿主的每一種組合分別提出的裂解條件不切實際，但仍可據(jù)下述一般準則來選擇適當方法，以取得滿意的結果。
1）大質粒（大于15kb）容易受損，故應采用漫和裂解法從細胞中釋放出來。將細菌懸于蔗糖等滲溶液中，然后用溶菌酶和EDTA進生處理，破壞細胞壁和細胞外膜，再加入SDS一類去污劑溶解球形體。這種方法zui大限度地減小了從具有正壓的細菌內部把質粒釋放出來所需要的作用力。
2）可用更劇烈的方法來分離小質粒。在加入EDTA后，有時還在加入溶菌酶后讓細菌暴露于去污劑，通過煮沸或堿處理使之裂解。這些處理可破壞堿基配對，故可使宿主的線狀染色體DNA變性，但閉環(huán)質粒DNA鏈由于處于拓撲纏繞狀態(tài)而不能彼此分開。當條件恢復正常時，質粒DNA鏈迅速得到準確配置，重新形成*天然的超螺旋分子。
3）一些大腸桿菌菌株（如HB101的一些變種衍生株） 用去污劑或加熱裂解時可釋放相對大量的糖類，當隨后用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心進行質粒純化時它們會惹出麻煩。糖類會在梯度中緊靠超螺旋質粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的區(qū)帶。因此很難避免質粒DNA內污染有糖類，而糖類可抑制多種限制酶的活性。 故從諸 如HB101和TG1等大腸桿菌蓖株中大量制備質粒時，不宜使用煮沸法。
4）當從表達內切核酸酶A的大腸桿菌菌株（endA+株，如HB101） 中小量制備質粒時，建議不使用煮沸法。因為煮沸不能*滅活內切核酸酶A，以后在溫育（如用限制酶消化）時，質粒DNA會被降解。但如果通過一個附加步驟（用酚：氯仿進行抽提）可以避免此問題。
5）目前這一代質粒的拷貝數(shù)都非常高，以致于不需要用氯霉素進行選擇性擴增就可獲得高產。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加質粒DNA的產量，而是要降低細菌細胞在用于大量制備的溶液中所占體積。大量高度粘稠的濃縮細菌裂解物，處理起來煞為費事，而在對數(shù)中期在增減物中加入氯霉素可以避免這種現(xiàn)象。有氯霉素存在時從較少量細胞獲得的質粒DNA的量以與不加氯霉素時從較大量細胞所得到的質粒DNA的量大致相等。

（三）質粒DNA的純化
常使用的所有純化方法都利用了質粒DNA 相對較小及共價閉合環(huán)狀這樣兩個性質。例如，用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心分離質粒和染色體DNA 就取決于溴化乙錠與線狀以及與閉環(huán)DNA分子的結合量有所不同。 溴化乙錠通過嵌入奮不顧身堿基之間而與DNA結合，進而使雙螺旋解旋。由此導致線狀DNA的長度有所增加，作為補償，將在閉環(huán)質粒DNA中引入超螺旋單位。zui后，超螺旋度大為增加， 從而阻止了溴化乙錠分了的繼續(xù)嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續(xù)結合更多的染料，直至達到飽和（ 每2個堿基對大約結合1個溴化乙錠分子） 。由于染料的結合量有所差別，線狀和閉環(huán)DNA分了在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來，氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質粒DNA 的方法。然而該過程既昂貴又費時，為此發(fā)展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過濾層析、分級沉淀等分離質粒DNA和宿主DNA的方法。本實驗室采用離子交換層析法已可得到*純度的質粒

二、質粒DNA的小量制備
細菌的收獲和裂解 收獲 堿裂解法 煮沸裂解 質粒DNA小量制備的問題與對策
質粒DNA的小量制備可采用下述的堿裂解法或煮沸法
（一）細菌的收獲和裂解
1．收獲
1）將2ml含相應抗生素的ＬＢ加入到容量為15ml 并通氣良好（不蓋緊）的試管中，然后接入一單菌落，于30℃劇烈振搖下培養(yǎng)過夜。
2）將1.5ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中，用微量離心機于4℃以12000g離心30秒，將剩余的培養(yǎng)物貯存于4℃。 3）吸去培養(yǎng)液，使細菌沉淀盡可能干燥。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠離細菌沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過抽真空除去附于管壁的液滴。

2．堿裂解法
1）將細菌沉淀，所得重懸于100μl用冰預冷的溶液Ｉ中，劇烈振蕩。
溶液Ｉ
50mmol/L葡萄糖
25mmol/L Tris．Cl（pH8.0）
10mmol/LEDTA（pH8.0）
溶液Ｉ可成批配制，每瓶約100ml,在10lbf/in2（6.895×104Pa） 高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于4℃。須確使細菌沉淀在溶液Ｉ中*分散，將兩個微量離心管的管底部互相接觸震蕩，可使沉淀迅速分散。

2）加200μl新配制的溶液Ⅱ。
溶液Ⅱ
0.2mol/L NaOH（臨用前用10mol/L貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋）
1%SDS
蓋緊管口，快速顛倒離心管5次，以混合內容物。應確保離心管的整個內表面 均與溶液Ⅱ接觸。不要振蕩，將離心管放置于冰上。
3）加150μl用冰預冷的溶液Ⅲ
溶液Ⅲ
5mol/Ｌ乙酸鉀
60ml 冰乙酸
11.5ml 水 28.5ml
所配成的溶液對鉀是3mol/L，對乙酸根是5mol/L。
蓋緊管口，將管倒置后和地振蕩10秒鐘溶液Ⅲ在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，之后 將管置于冰上3－5分鐘。
4）用微量離心機于4℃12 000g離心5分種，將上清轉移到另一離心管中。
5）可做可不做：加等量酚：氯念， 振蕩混勻， 用微量離心機于4 ℃以12000g離心 2分鐘，將上清轉移到另一良心管中。有些工作者認為不*酚：氯仿進行抽提，然而由于一些未知的原因，省略這一步，往往會得到可耐受限制酶切反應的DNA。
6）用2倍休積的乙醇于室溫沉淀雙錠DNA。振蕩混合， 于室溫放置2分鐘。
7）用微量離心機于4℃以12 000g離心5分鐘。
8）小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，并用吸頭接觸液面。當液體從管中吸出時，盡量使吸頭遠離核酸沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過抽真空除去附于管壁的液滴。
9）用1ml70%乙醇于4℃洗滌雙鏈DNA沉淀，按步驟8）所術方法去掉上清，在空氣中使核酸沉淀干燥10分鐘。

i.此法制備的高拷貝數(shù)質粒（如Ｘf3或pUC），其產量一般約為：每毫升原細菌培養(yǎng)物3－5μg。
ii．如果要通過限制酶切割反應來分析DNA，可取1μl DNA溶液加到另一含8μl水的微量離心管內，加1μl 10×限制酶緩沖液和1單位所需限制酶， 在適宜溫育1－2小時。將剩余的DNA貯存于－20℃。
iii.此方法按適當比例放大可適用于100ml細菌培養(yǎng)物：
3．煮沸裂解
1）將細菌沉淀，所得重懸于350μlSTET中。
STET
0.1mol/L NaCL
10mmol/L Tris.Cl（pH8.0）
1mmol/L EDTA（pH8.0）
5% Triton X-100
2）加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl（pH8.0）配制]，振蕩3秒鐘以混勻之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效發(fā)揮作用。
3）將離心管放入煮沸的水浴中，時間恰為40秒。
4）用微量離心機于室溫以12 000g離心10分種。
5）用無菌牙簽從微量離心管中去除細菌碎片。
6）在上清中加入40μl 5mol/L乙酸鈉（pH5.2）和420μl異丙醇，振蕩混勻，于室溫放置5分鐘。
7）用微量離心機于4℃以12 000g離心5分種，回收核酸沉淀。
8）小心吸去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡。除去上清的簡便方法是用一次性使用的吸頭與真空管道相連，輕緩抽吸，并用吸頭接觸液面。當液體從管中吸出時，盡可能使吸頭遠離核酸沉淀，然后繼續(xù)用吸頭通過抽真空除去附于管的液滴。
9）加1ml 70％乙醇，于4℃以12 000g離心2分鐘。 10）按步驟8）所述再次輕輕地吸去上清，這一步操作要格外小心，因為有時沉淀塊貼壁不緊，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打開管口，放于室溫直至乙醇揮發(fā)殆盡，管內無可見的液體（2－5）分鐘。 11）用50μl含無DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE（pH8.0）溶解核酸稍加振蕩，貯存于-20℃。 注：當從表達內切核酸酶Ａ的大腸桿菌株（endA+株，如HB101 ）中小量制粒尤其DNA時，建議舍棄煮沸法。因為煮沸步驟不能*滅活內切核酸酶Ａ，以后在Mg ²⁺存在下溫育（V中用限制酶時）質粒DNA可被降解。 在上述方案的步驟9）之間增加一步，即用酚：氯仿進行抽提，可以避免這一問題。

（二）質粒DNA小量制備的問題與對策
裂解和煮佛法都極其可靠，重復性也很好，而且一般沒有會么麻煩。多年來，在我們實驗室中日常使用這兩種方法的過程中，只碰到過兩個問題：
1）有些工作者進行小量制備時，有時會發(fā)現(xiàn)質粒DNA不能被限制酶所切割，這幾乎總是由于從細菌沉淀或從核酸沉淀中去除所有上清液時注意得不夠。大多數(shù)情況下，用酚：氯仿對溶液進行抽提可以去除小量備物中的雜質。如果總是依然存在，可用離心柱層析注純化DNA。
2）在十分偶然的情況下，個別小時制備物會出現(xiàn)無質粒DNA的現(xiàn)象。這幾乎肯定是由于核酸沉淀顆粒已同乙醇一起被棄去。
三、質粒DNA的大量制備
在豐富培養(yǎng)基中擴增質粒
細菌的收獲和裂解
收獲
堿裂解法

（一）在豐富培養(yǎng)基中擴增質粒 許多年來，一直認為在氯霉素存在下擴增質粒只對生長在基本培養(yǎng)基上的細菌有效，然而在帶有pMBl或ColEl復制子的高拷貝數(shù)質粒的大腸桿菌菌株中，采用以下步驟可提高產量至每500ml培養(yǎng)物2－5mg質粒DNA，而且重復性也很好。
1）將30ml含有目的質粒的細菌培養(yǎng)物培養(yǎng)到對數(shù)晚期（DNA 600約0.6）。培養(yǎng)基中應含有相應抗生素，用單菌落或從單菌落中生長起來的小量液體閉關物進行接種。
2）將含相應抗生素的500ml ＬＢ或Terrific肉湯培養(yǎng)基（預加溫至37℃）施放入25ml對數(shù)晚期的培養(yǎng)物，于37℃劇烈振搖培養(yǎng)25小時（搖床轉速300轉/分），所得培養(yǎng)物的OD 600值約為0.4。
3）可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液（34mg/ml溶于乙醇），使終濃度為170μg/ml。像pBR322一類在宿主菌內只以中等拷貝婁竿行復的質粒，有必要通過擴增。這些質粒只要從生長達到餉新一代的質粒（如pUC質粒）可復制達到很高的拷貝數(shù)，因此無需擴增。這些質粒只要從生長達到飽和的細菌培養(yǎng)物即可大量提純。但用氯霉素進行處理，具有抑制細菌復制的優(yōu)點，可減少細菌裂解物的體積和粘稠度，極大地簡化質粒純化的過程。所以一般說來，盡管要在生長中的細菌培養(yǎng)物里加入氯霉素略顯不便，但用氯霉素處理還是利大于弊。 4）于37℃劇烈振搖（300轉/分），繼續(xù)培養(yǎng)12-16小時。

（二）細菌的收獲和裂解
1．收獲
1）用合適轉頭于4℃以4000轉/分離心15分鐘，棄上清，敞開離心管口并倒置離心管使上清全部流盡。
2）將細菌沉淀重懸于100ml用冰預冷的STE中。
STE
0.1mol/L NaCl
10mmol/L Tris.Cl（pH8.0）
1mmol/L EDTA（pH8.0）
2）按步驟1）所述方法離心，以收集細菌細胞。

2，堿裂解法
1）將冼過的500ml 培養(yǎng)物的細菌沉淀物[ 來自收獲細菌的步驟3] 重懸于10ml（18ml）溶液Ｉ中。
溶液Ｉ
50mmol/L葡萄糖
25mmol/L Tris.Cl（pH8.0）
10mmol/L EDTA（pH8.0）
溶液Ｉ可成批配制，在10 lbf/in2（6.895x104Pa）高壓下蒸氣滅菌15分鐘，貯存于4℃。
2）加1ml（2ml）新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl（pH8.0）]。當溶液的pH值低于8.0時，溶菌酶不能有效工作。
3）加20ml（40ml）新配制的溶液Ⅱ。
溶液Ⅱ
0.2mol/L NaOH（臨用前用10mol/L貯存液現(xiàn)用現(xiàn)稀釋）
1％SDS
蓋緊瓶蓋，緩緩顛倒離心瓶數(shù)次，以充分混勻內容物。于室溫放置5-10分鐘。
4）加15nl（20ml）用冰預冷的溶液Ⅲ。
溶液Ⅲ
5mol/L乙酸鉀
60ml 冰乙酸
11.5ml 水
28.5ml 所配成的溶液對鉀是3mol/L，對乙酸根是5mol/L。
封住瓶口，搖動離心瓶數(shù)次以混勻內容物，此時應不再出現(xiàn)分明的兩個液相。置冰上放10分鐘，應形成一白色絮狀沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀應包括染體DNA、 高分子量RNA和鉀－SDS－蛋白質－膜復合物。
5）用合適轉頭于4℃以4000轉/分離心15分鐘，不開剎車而使轉頭自然停轉。如果細菌碎片貼壁不緊，可以5000轉/分再度離心20分鐘， 然后盡可能將上清全部轉到另一瓶中，棄去殘留在離心管內的粘稠狀液體。未能形成致密沉淀塊的原因通常是由于溶液Ⅲ與細菌裂解物混合不充分[步驟4）]。
6）上清過濾至一250ml離心瓶中，加0.6體積的異丙醇，充分混勻，于室溫放置10分鐘。
7）用合適轉頭于室溫以500轉/分離心15分鐘，回收核酸。如于4℃離心，鹽也會了生沉淀。
8）小心倒掉上清，敞開瓶口倒置離心瓶使殘余上清液流盡，于室溫用70％乙醇洗滌沉積管壁。倒出乙醇，用與真空裝置相聯(lián)的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室溫將瓶倒置放在紙巾上，使zui后殘余的痕量乙醇揮殆盡。
9）用3ml TE（pH8.0）溶解核酸沉淀。

四、質粒DNA的純化
聚乙二醇沉淀法質粒DNA
氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環(huán)DNA
（一）聚乙二醇沉淀法提取質粒DNA
1）將核酸溶液所得]轉入15mlＣorex 管中， 再加3ml 用冰預冷的5mol/L LiCl溶液，充分混勻，用合適轉頭于4℃下以10 000轉/分離心10分鐘。LiCl可沉淀高分子RNA。
2）將上清轉移到另一30mlCorex管內，加等量的異丙醇， 充分混勻， 用SorvallSS34轉頭（或與其相當?shù)霓D尖）于室溫以10 000轉/分離心10分釧， 回收沉淀的核酸。
3）小心去掉上清，敞開管口，將管倒置以使zui后殘留的液滴流盡。于室溫用70％乙醇洗滌沉淀及管壁，流盡乙醇，用與真空裝置相連的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞開管口并將管侄置，在紙巾上放置幾分鐘，以使zui后殘余的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。
4）用500μl含無DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml ）的TE（pH8.0）溶解沉淀，將溶液轉到一微量離心管中，于室溫放置30分鐘。
5）加500μl含13％（w/v）聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量離心機于4℃以12000g離心5分鐘，以回收質粒DNA。
6）吸出上清，用400μl TE（pH8.0）溶解質粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽1次。
7）將水相轉到另一微量離心管中，加100μl 10mol/L乙醇銨，充分混勻，加2倍體積（約1ml）乙醇，于室溫放置10分鐘，于4℃以12 000g離心5分鐘，以回收沉淀的質粒DNA。
8）吸去上清，加200μl處于4℃以12 000g離心2分鐘。
9）吸去上清，敞開管口，將管置于實驗桌上直到zui后可見的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。 10）用500μl TE（pH8.0）溶解沉淀1:100稀釋[用TE（pH8.0）] 后測量OD 260，計算質粒DNA的濃度（1OD260＝50μg質粒DNA/ml）， 然后將DNA貯于－20℃。
10）純化。