丙酮酸激酶PK是糖酵解途徑的一個(gè)關(guān)鍵酶，目前研究表明，幾乎所有不同組織來(lái)源的腫瘤均伴有丙酮酸激酶的異構(gòu)重整體M2-PK的過(guò)度表達(dá), 故稱為腫瘤型M2-PK（Tumor M2-PK，Tu M2-PK）。在正常細(xì)胞中，M2-PK主要以三聚體的形式存在，而在腫瘤細(xì)胞中，M2-PK大量表達(dá)并轉(zhuǎn)變?yōu)橹饕远垠w的形式存在。三聚體的M2-PK與磷酸烯醇丙酮酸PEP親和力很高，而二聚體的M2-PK與PEP的親和力則低的多，后者因此導(dǎo)致磷酸烯醇類物質(zhì)的堆積，這有利于腫瘤細(xì)胞進(jìn)行無(wú)氧糖酵解。

Tu M2-PK的升高可見(jiàn)于大多數(shù)癌癥患者。盡管不同組織來(lái)源的腫瘤或同種腫瘤的不同階段，其血中M2-PK的平均水平存在著一定的差別，但作為腫瘤標(biāo)志物，M2-PK是很有應(yīng)用價(jià)值的。尤其是腎癌，長(zhǎng)期以來(lái)一直未發(fā)現(xiàn)較特異的腫瘤標(biāo)志物,M2-PK很可能成為目前*可用于臨床診斷腎癌的生化指標(biāo)。早在1993年，在Hamburg召開的（德國(guó)）第七界腫瘤標(biāo)志物研討會(huì)上，Tu M2-PK就作為一種新的腫瘤標(biāo)志物被提了出來(lái)。不過(guò)，比較其特異性而言，Tu M2-PK的靈敏度相對(duì)偏低。所以，用于診斷和篩選腫瘤患者，Tu M2-PK還應(yīng)與其他有關(guān)的腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)，以同時(shí)提高臨床診斷的特異性和靈敏度。

本試劑盒能靈敏的高特異性地檢測(cè)出人體血液內(nèi)的Tu M2-PK------一種可以用于癌癥的篩查、診斷和跟蹤治療的新的腫瘤標(biāo)記物。

本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心法原理，抗人M2-PK單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和EDTA血漿標(biāo)本中的M2-PK就會(huì)與板上的單抗結(jié)合，被固定，通過(guò)洗板，將未結(jié)合的游離成分洗去；再加入生物素化的M2-PK的抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親合素。生物素和親合素特異性結(jié)合；抗人M2-PK抗體與結(jié)合在單抗上的M2-PK結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色劑，若反應(yīng)孔中有M2-PK，辣根

 

 

                                                                  1

過(guò)氧化物酶會(huì)使無(wú)色的顯色劑顯藍(lán)色，加終止液變黃，在450nm處測(cè)OD值，M2-PK濃度與所測(cè)OD450值成正比，可通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中M2-PK濃度。

包被有腫瘤M2-PK單克隆抗體的酶標(biāo)板（12ⅹ8孔）

腫瘤M2-PK標(biāo)準(zhǔn)品1→4個(gè)  4×1.0 ml         質(zhì)控液           1×1.0 ml

腫瘤M2-PK多抗           1×10 ml          酶聯(lián)物           2×6.0 ml

濃縮洗滌液（25ⅹ）        1×20 ml          底物A           1×6.0ml

濃縮標(biāo)本稀釋液（10×）    1×10 ml          底物B           1×6.0ml 

終止液                    1×6.0ml

血漿抗凝劑只能使用EDTA，其他血漿均不能使用。建議1-2小時(shí)內(nèi)離心，避免劇烈搖動(dòng)。（2000g離心十分鐘）。標(biāo)本在4⁰C可以保存一天，在-20⁰C可以保存一年。標(biāo)本收集后若不及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融。

1．   500ml的量筒;  2 ml、5 ml、10 ml的吸管;  酶標(biāo)儀（450+10nm）一臺(tái)

2．   微量加樣器：0-50μl，50-200μl，200-1000μl

可行的加樣板設(shè)計(jì):

S1~S42：EDTA血漿標(biāo)本       Blank：吸入100微升標(biāo)本洗滌液在A1和A2孔

 

2

STD：    標(biāo)準(zhǔn)品             PC：  質(zhì)控液

標(biāo)準(zhǔn)品：在*條和第二條孔中各加入100微升標(biāo)準(zhǔn)品，作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)

1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品=8U/ml             2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品=15U/ml

3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品=35U/ml            4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品=50U/ml

1.        標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控液的準(zhǔn)備：向盛有標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控液的小瓶中各加入500μl標(biāo)本稀釋液，并充分混勻。

2.        質(zhì)控液： 20U/ml±10%  在F1和F2孔中各加100μl。

3.        標(biāo)本洗滌液的準(zhǔn)備： 20ml濃縮洗滌液（25ⅹ）+400ml蒸餾水，此份稀釋液在4-8⁰C可保存六周。

4.        標(biāo)本稀釋液的準(zhǔn)備： 用蒸餾水按1：10稀釋，稀釋后放2-8℃保存。

5.        酶標(biāo)板的準(zhǔn)備： 在打開之前把酶標(biāo)板置于室溫，取需要量的酶標(biāo)板置于框架內(nèi)，未使用的酶標(biāo)板于有干燥劑的密封塑料袋中保存。

6.       EDTA血漿的稀釋（1：100）: 10μl EDTA血漿+1ml標(biāo)本稀釋液，充分混合。

7.        按照待測(cè)標(biāo)本數(shù)目取相應(yīng)的酶標(biāo)板條于框架上，除空白孔外，分別將標(biāo)本和不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控液（100μl/孔）加入相應(yīng)孔中（做雙孔），振蕩均勻，于37⁰C，溫育60min。

8.        取出反應(yīng)的酶標(biāo)板條，倒掉孔內(nèi)的液體，加入標(biāo)本洗滌液洗滌5次，于干凈的紙上拍干，除去殘留的液體，向每孔中加入M2-PK多抗100μl，振蕩均勻，于37⁰C，溫育30min。

9.        取出反應(yīng)的酶標(biāo)板條，倒掉孔內(nèi)的液體，加入標(biāo)本洗滌液洗滌5次，于干凈的紙上拍干，除去殘留的液體，向每孔中加入酶聯(lián)物100μl，振蕩均勻，于37⁰C，溫育30min。

10.     取出反應(yīng)的酶標(biāo)板條，倒掉孔內(nèi)的液體，加入標(biāo)本洗滌液洗滌5次，于干凈的紙上拍干，除去殘留的液體，向每孔中加入A、B底物各50μl，振蕩均勻，于37⁰C，溫育10-15min。

10.  取出反應(yīng)的酶標(biāo)板條，立即向每孔中加入50μl終止液，于5分鐘內(nèi)在450 nm處用酶標(biāo)儀讀出吸光度。

結(jié)果判斷：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，OD值作縱坐標(biāo)，以平滑線連接各標(biāo)準(zhǔn)品的坐c標(biāo)點(diǎn)。通過(guò)標(biāo)本的OD值可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度。

參考濃度≤15U M2-PK/ml  EDTA 血漿，對(duì)應(yīng)90%的參照組除腫瘤病還感染有其他疾病。

含量在15-20U/ml的數(shù)值為不確定的可疑血漿。

1．   所有的試劑和酶標(biāo)板在使用之前均要平衡至室溫。

2．   使用前應(yīng)搖勻所有的液體試劑，但要防止瓶蓋上沾有試劑。

3．   操作時(shí)應(yīng)該按照相同的程序操作和相同的時(shí)間間隔。

4．   為了避免污染，使用干凈的加樣器吸管和干凈的容器，不要使用同一個(gè)容器來(lái)盛裝不同的試劑。

5．   每次洗滌時(shí)要倒置酶標(biāo)板于干凈的紙巾上拍打，除去殘留液體，避免液體回濺，培養(yǎng)過(guò)程中的洗滌每次至少要1分鐘。

6．   加試劑和樣本之后應(yīng)振蕩酶標(biāo)板以保證試劑的均勻分布，若有泡沫請(qǐng)用干凈的針除去。

7．   實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中要注意安全，避免皮膚直接接觸標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控液，更不能用嘴吸液，要帶手套，不同批號(hào)的材料不要混用。

8．  操作完成要按照說(shuō)明妥善保管好各種試劑。

1. 本試驗(yàn)結(jié)果需結(jié)合臨床表現(xiàn)、病史及其他診斷結(jié)果方可采取適當(dāng)臨床處理。

2. 2－8℃貯存,貯存至有效期結(jié)束；不同批號(hào)的試劑不能混用，標(biāo)本稀釋液及酶聯(lián)物不能凍結(jié)。本試劑盒有效期九個(gè)月。